Khoảng 2 giờ sáng ngày 12 tháng 6 năm 2016, Mateen bắt đầu xả súng tại hộp đêm đồng tính Pulse ở Orlando, Florida. Có 49 người thiệt mạng, 52 người bị thương, 30 con tin được giải cứu, 1 cảnh sát SWAT bị thương và Mateen bị cảnh sát SWAT tiêu diệt tại chỗ. Đây là vụ tấn công xả súng thảm khốc nhất lịch sử Hoa Kỳ,[22] vụ tấn công chống lại cộng đồng LGBT Mỹ đẫm máu nhất[23] và là vụ khủng bố làm chết nhiều người nhất xảy ra tại Mỹ kể từ sự kiện 11 tháng 9 năm 2001.[24][25]